Cephalopod + Tomocube = nový „refrakční tag“ pro molekulární zobrazovací sondy

Poprvé byla provedena genetická manipulace s indexem optické lomu proteinu uvnitř živé buňky, která vedla k jeho použití jako zobrazovací molekulární sondy

Vědecké týmy z Salk Institute for Biological Studies a Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo poprvé použili proteiny hlavonožců odpovědné za změny barvy a odrazivosti k manipulaci s indexem optické lomu (RI) proteinů uvnitř buněčných kompartmentů savčích buněk. Změnu této přirozené fyzikální vlastnosti proteinů by mohli brzy využít pro zobrazování pomocí analýzy indexu lomu (RI) u živých buněk a zachytit výsledné kvantitativní fázové obrazy bez nutnosti dalšího značení pomocí holotomografického mikroskopu Tomocube.

Gerald M Pao a jeho kolegové geneticky manipulovali s RI cílových struktur u živých buněk syntézou známých genů reflektinu a klonováním nových genů pro reflexin, u nichž se očekává vyšší RI původem z hlavonožců, konkrétně z útesových sépií druhů Sepioteuthis lessoniana a Euprymna scolopes.

cDNA pro reflectin syntetizované za použití lidského kodonu byly označeny epitopem pro rozpoznávání protilátkou - buď HA nebo FLAG tagem. Dále byla do konstruktu vložena preprotrypsinová signální sekvenci pro zacílení proteinu na sekreční dráhu a pro specifické ER cílení byl použit C-koncový KDEL ER retenční signál.

Po transfekci ve pBOB-CAG vektoru do lidských embryonálních ledvinných buněk 293 a 293T byly tyto struktury úspěšně zobrazeny pomocí kvantitativního fázového kontrastního mikroskopu Tomocube, kde holotomografický mikroskop tak rozlišil zvýšený RI reflectinů, který se pohybuje okolo 1,4, od RI ostatních struktur endoplazmatického retikula jejich přirozený RI je okolo 1,35. Poprvé se tak podařilo zobrazit intracelulární struktury u živé buňky bez fluorescence jen za použití změn refrakčního indexu. Tato metoda tedy otevírá cestu pro dlouhodobé zobrazovací experimenty, neboť eliminuje problémy fotobleachingu a fototoxicity, a současně zajišťuje zobrazení živých neovlivněných a neznačených buněk ve vysokém rozlišení. Jedním z budoucích použití této nové technologie může být manipulace s RI celých tkání za účelem dosažení jejich transparentnosti prostřednictvím shody indexu lomu. To dosud vyžadovalo fixní, permeabilizované vzorky celých orgánů, což vylučuje zobrazení živých struktur. U geneticky upraveného proteinu to však může být teoreticky možné.

Zobrazení transfekovaného konstruktu uvnitř cílových buněk pomocí fluorescenčně značené protilátky proti specifickému tagu

Zobrazení transfekovaného konstruktu pomocí QPI

Reflectiny

Reflectinové proteiny jsou hlavními složkami odpovědnými za strukturální zabarvení a duhovost hlavonožců, které používají hlavně pro maskování. Nacházejí se ve specializovaných buňkách, iridoforech, tvořících Braggova zrcadla střídáním vrstev materiálu s vysokým a nízkým indexem lomu. Ve vrstvách membrán tvoří reflectiny nanočástice <5 nm až> 500 nm a propůjčují iridoforům vlastnost vysokého optického indexu lomu. Reflectiny jsou tak používány hlavonožci pro rozptyl bílého světla a pro dosažení chromatické invariance pigmentových vezikulů chromatoforů, které se rozpínají nebo smršťují.

Adaptivní iridocyty v kůži sépie jsou schopny vyladit barvu v celé šířce spektra.

Holotomografický mikroskop Tomocube

Technologie holotomografického zobrazování (QPI) poskytuje rychle a jednoduše bez jakékoli přípravy vzorku kvantitativní 3D obraz jednotlivých živých buněk v nanoměřítku v reálném čase bez nutnosti dalšího značení. Holotomografické obrázky jsou schopné poskytnout důležité informace o jedinečných vlastnostech buněk, včetně objemů, tvarů subcelulárních organel, cytoplazmatické hustoty, povrchu a deformovatelnosti. Nejnovější model miktoskopu Tomocube HT-2 kombinuje přístup kvantitativního fázového zobrazování (QPI) bezografické tomografie 3-D indexu lomu (RI) s 3-D fluorescenčním zobrazováním. Tento mikroskop, který je vítězem ceny za inovaci Microscopy Today 2019, umožňuje dlouhodobé sledování konkrétních cílů v živých buňkách při minimalizaci stresu zobrazovaných buněk. Schopnost kombinovat dvě zobrazovací techniky - holotomografii a fluorescenční korelační analýzu ve 2D, 3D a 4D umožní vědcům a lékařům otevřít nové hranice v biologických vědách a lépe porozumět, diagnostikovat a léčit nemoci.

Reference

Doi:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.09.196436v1

Genetic manipulation of the optical refractive index in living cells.

Junko Ogawa, Yoko Iwata, Nina U Tonnu, Chitra Gopinath, Ling Huang, Sachihiko Itoh, Ryoko Ando, Atsushi Miyawaki, Inder M Verma, and Gerald M Pao

About Tomocube, Inc.

Tomocube is dedicated to delivering products that can enhance biological and medical research via novel optical solutions that can assist in understanding, diagnosing, and treating human diseases. Our microscope platform enables researchers to measure nanoscale, real-time, dynamic images of individual living cells without the need for sample preparation through the measurement of 3D refractive index tomograms. This enables researchers and clinicians to work with primary cells and non-invasively observe label-free 3D dynamics of live cells and tissues, make quantitative measurements, and retrieve unique cell properties such as cell volume, cytoplasmic density, and surface area. Founded in 2016, Tomocube provides a series of HT microscopy to the market and won the 2019 Microscopy Today 2019 Innovation Award for  the HT-2, the world’s first correlative microscope to combine the quantitative phase imaging (QPI) approach of label-free, 3-D refractive index (RI) tomography with 3-D fluorescence imaging. To find out more about Tomocube, visit www.tomocube.com .