Label-free 3D zobrazování živých biofilmů bez barvení, fixace a fototoxicity

Mikrobiální biofilmy patří mezi nejodolnější formy mikrobiálního života. Nejde pouze o shluk bakterií přichycený k povrchu. Biofilm je prostorově organizovaná komunita buněk obklopená vlastní extracelulární polymerní matrix, často označovanou jako EPS. Právě tato matrix chrání mikroorganismy před vnějšími vlivy, zpomaluje průnik antimikrobiálních látek a vytváří prostředí, ve kterém mohou přežívat i méně aktivní nebo dormantní buňky.

A právě zde vzniká zásadní problém.

Klasické metody analýzy biofilmů často poskytují jen nepřímý nebo koncový výsledek. Barvení, fixace, fluorescenční sondy nebo destruktivní assay mohou změnit stav vzorku, narušit jeho strukturu nebo ukázat pouze jeden časový bod. Pro výzkum biofilmů je přitom často důležité sledovat, jak se komunita vytváří, jak roste do prostoru, jak se mění její vnitřní architektura a jak reaguje na léčbu v reálném čase.

Holotomografie Tomocube nabízí jiný přístup. Umožňuje zobrazovat živé mikrobiální biofilmy ve 3D bez značení, fixace a fotobleachingu. Kontrast nevzniká pomocí barviv, ale na základě rozdílů indexu lomu. Díky tomu lze sledovat bakteriální buňky i strukturu biofilmu v jejich přirozenějším stavu a současně získávat kvantitativní informace o objemu, biomase nebo suché hmotě.

Co holotomografie přináší do výzkumu biofilmů

Label-free live imaging
Biofilm lze sledovat v živém stavu bez fluorescenčního značení, fixace nebo barvení. To je důležité zejména u časosběrných experimentů a u citlivých vzorků.

 

 


3D pohled na architekturu biofilmu
Metoda poskytuje prostorovou informaci o buňkách, mikro-koloniích a struktuře biofilmu. Pomáhá hodnotit uspořádání, tloušťku a vnitřní změny.

 

 


Dlouhodobé time-lapse sledování
Vzorek lze pozorovat v průběhu minut, hodin i dnů - od počáteční adheze až po reakci na antimikrobiální zásah.

 

 


Kvantitativní fenotypizace
Z dat založených na indexu lomu lze získat kvantitativní parametry, například biomasu, objem, tloušťku biofilmu nebo suchou hmotu.

 

 

Proč nestačí běžné endpoint assay

U biofilmů se opakují čtyři praktické výzvy: biofilm je prostorová struktura, kterou nelze plně popsat jedním 2D obrazem; barvení a fixace mohou ovlivnit živý vzorek nebo znemožnit dlouhodobé sledování; endpoint assay často neukážou, kdy a jak přesně antimikrobiální látka působí; a bulk měření zakrývají rozdíly mezi jednotlivými buňkami, mikro-koloniemi a oblastmi biofilmu.

To je limitující zejména při vývoji nových antimikrobiálních látek, testování antimikrobiálních peptidů, sledování účinku antibiotik nebo hodnocení nanomateriálů. V těchto situacích nestačí vědět pouze to, zda biofilm po určité době přežil. Výzkumníci potřebují vidět, jak se mění jeho struktura, zda dochází k narušení matrix, jak reagují jednotlivé buňky a zda je efekt postupný, lokální nebo rychlý a plošný.

 

Sledování vzniku biofilmu ve 3D

Raná fáze tvorby biofilmu je pro mikroskopii náročná. První přichycení plakových buněk k povrchu, jejich agregace a vznik počáteční prostorové struktury probíhají dynamicky. Jakmile se vzorek zafixuje nebo obarví, získáme sice obraz, ale ztratíme možnost sledovat přirozený průběh procesu.
Holotomografie tento problém obchází. Umožňuje pozorovat vznik biofilmu přímo v živém vzorku. V aplikačním příkladu Tomocube je časosběrné 3D zobrazení použito pro sledování počáteční adheze, agregace buněk a formování rané biofilmové struktury u Pseudomonas aeruginosa.

 

Data courtesy of the Yilin Wu Lab, Department of Physics, The Chinese University of Hong Kong.

 

Antimikrobiální peptidy a sledování biofilmu v reálném čase

Vývoj nových antimikrobiálních látek proti biofilmům vyžaduje víc než jen koncové měření viability. U biofilmu je důležité sledovat, jak rychle vzniká, jak se zahušťuje, jak se mění jeho objem a zda testovaná látka zasahuje především bakteriální buňky, extracelulární matrix, nebo celou biofilmovou strukturu. Ve studii Kumar et al. byla 3D optická difrakční tomografie (3D-ODT) použita ke sledování tvorby biofilmu multirezistentního Acinetobacter baumannii (MDRAB) v reálném čase. Autoři porovnávali neošetřenou kontrolu s biofilmem ošetřeným antimikrobiálním peptidem Hirunipin 2. Díky rozdílům v indexu lomu bylo možné odlišit živé bakteriální buňky od extracelulárních komponent biofilmu a současně kvantifikovat změny suché hmoty, povrchové plochy a objemu biofilmu. Zatímco v kontrolním vzorku biofilm během 12 hodin postupně narůstal, po ošetření Hirunipinem 2 byla tvorba biofilmu výrazně potlačena. Studie tak ukazuje, že holotomografie / ODT může sloužit nejen jako zobrazovací metoda, ale také jako kvantitativní nástroj pro hodnocení antibiofilmového účinku nových antimikrobiálních peptidů.

Real-time ODT zobrazování tvorby biofilmu MDRAB a účinku antimikrobiálního peptidu Hirunipin 2. 

Panel a ukazuje experimentální schéma časosběrného ODT zobrazování biofilmu a barevnou mapu indexu lomu. Panely b a c zobrazují reprezentativní 3D-ODT obrazy biofilmů MDRAB během 12 hodin: neošetřenou kontrolu a vzorek ošetřený Hirunipinem 2. Pro každý časový bod je nahoře uveden izometrický pohled a dole pohled v ose Y, který umožňuje sledovat změny tloušťky biofilmu. Panely d a e ukazují segmentované 3D-ODT obrazy vyznačených oblastí z panelů b a c ve specifických rozmezích indexu lomu: RI = 1.340–1.350 pro extracelulární komponenty biofilmu a RI = 1.351–1.380 pro živé buňky MDRAB. Panely f–h uvádějí kvantitativní analýzu suché hmoty, povrchové plochy a objemu biofilmu po ošetření antimikrobiálními peptidy. Panel i ukazuje eradikační aktivitu hirunipinových peptidů a LL-37 proti kmeni MDRAB (329–53). Barevná škála odpovídá 3D renderovanému rozmezí indexu lomu 1.340–1.380. Měřítko = 30 µm. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SD. Upraveno podle Kumar et al., 2025.

S. D. Kumar, J. Park, N. K. Radhakrishnan, Y. P. Aryal, G.-H. Jeong, I.-H. Pyo, B. Ganbaatar, C. W. Lee, S. Yang, Y. Shin, S. Subramaniyam, Y. Lim, S.-H. Kim, S. Lee, S. Y. Shin, S.-J. Cho, Novel Leech Antimicrobial Peptides, Hirunipins: Real-Time 3D Monitoring of Antimicrobial and Antibiofilm Mechanisms Using Optical Diffraction Tomography. Adv. Sci.2025, 12, 2409803. https://doi.org/10.1002/advs.202409803

 

Hodnocení antimikrobiálních nanomateriálů

3D holotomografické zobrazení buněk v kontextu hodnocení antimikrobiálních nanomateriálů. Obrazový podklad: Tomocube.

Další oblastí jsou antimikrobiální nanomateriály. U nich mohou být klasické kolorimetrické assay problematické, například kvůli interferenci kovových iontů s optickým odečtem. V takové situaci je výhodné mít nezávislý strukturální readout založený na přímém zobrazení biofilmu.

V práci Martínez-Montelongo et al. publikované v Ceramics International v roce 2024 byla holotomografie v kombinaci s mikroskopií atomárních sil použita pro hodnocení magnetických nanomateriálů CuFe₂O₄ a CuFe₂O₄/ZnO proti biofilmům Candida. Trojrozměrné zobrazení založené na indexu lomu umožnilo hodnotit strukturální narušení biofilmu i intracelulární poškození buněk uvnitř biofilmové struktury.

 

Biofilm, mikrobiální ekologie a buněčná plasticita

Holotomografie nemusí sloužit pouze k testování antimikrobiálních látek. Uplatní se také tam, kde je potřeba propojit buněčnou morfologii, prostorovou organizaci a funkci mikrobiální komunity. Ve studii Fernández-Juárez et al. autoři zkoumali Rhodopseudomonas sp. BAL398, anoxygenní fototrofní bakterii izolovanou z povrchových vod Baltského moře. Ukázali, že světlo, kyslík a dostupnost živin ovlivňují nejen růst a fixaci dusíku, ale také tvorbu biofilmu a výraznou buněčnou plasticitu. Holotomografické zobrazování v kombinaci s fluorescenční detekcí nitrogenázy umožnilo zachytit jednotlivé tyčinkovité buňky, rozetovité buněčné struktury i cystám podobné formy. Právě rozetovité struktury byly spojeny s podmínkami maximální fixace N₂; nitrogenáza se v nich koncentrovala směrem do středu struktury a jejich výskyt byl za těchto podmínek výrazně vyšší. Studie tak ukazuje, že prostorové uspořádání buněk a schopnost měnit morfologii mohou hrát důležitou roli v tom, jak tato bakterie zvládá kyslíkový stres a udržuje diazotrofní aktivitu.

Vliv světla, O₂ a živin na buněčnou strukturu a bakteriální kapsuli u Rhodopseudomonas sp.

BAL398 v podmínkách fixace N₂. Panel A ukazuje tyčinkovitou buňku BAL398 v anoxických podmínkách, panel B rozetovité buněčné struktury; zelený signál odpovídá nitrogenáze detekované imunoznačením. Panel C kvantifikuje počet rozet v závislosti na světle, O₂ a dostupnosti dusíku. Panel D ukazuje tvorbu cystám podobných struktur v aerobních podmínkách při světle a fixaci dusíku. Panel E zobrazuje tyčinkovitou buňku v oxických podmínkách. V panelech A, D a E modrá, červená a šedá barva označují vnitřní membránu, vnější membránu a kapsuli; modrá barva v panelu D označuje možné velké intracelulární granule. Panel F schematicky shrnuje délku, šířku a tloušťku kapsule podle světelných a kyslíkových podmínek. Upraveno podle Fernández-Juárez et al., 2023.

Fernández-Juárez V, Hallstrøm S, Pacherres CO, Wang J, Coll-Garcia G, Kühl M, Riemann L. 2023. Biofilm formation and cell plasticity drive diazotrophy in an anoxygenic phototrophic bacterium. Appl Environ Microbiol 89:e01027-23.
https://doi.org/10.1128/aem.01027-23

 

Nad rámec biofilmů: fenotypizace jednotlivých bakteriálních buněk

Stejný princip lze využít i mimo klasické biofilmové modely. U průmyslové mikrobiologie je například důležité kvantifikovat intracelulární akumulaci polymerů v jednotlivých buňkách. Bulk metody mohou poskytnout celkovou hodnotu, ale neukážou rozdíly mezi jednotlivými buňkami ani lokalizaci granulí uvnitř buňky.

V práci Choi et al. publikované v PNAS v roce 2021 byla holotomografie použita pro label-free 3D vizualizaci a kvantifikaci polyhydroxyalkanoátových granulí v živých buňkách Cupriavidus necator a rekombinantních Escherichia coli. Metoda umožnila měřit objem, hmotnost, hustotu a intracelulární lokalizaci PHA granulí v nativním stavu.

 

Pro koho je holotomografie při výzkumu biofilmů vhodná

Holotomografie Tomocube je vhodná zejména pro týmy, které potřebují sledovat biofilmy ve 3D, v čase a s minimálním zásahem do vzorku. Uplatnění najde například při:

  • výzkum tvorby a zrání mikrobiálních biofilmů,
  • testování antibiotik a antimikrobiálních peptidů,
  • hodnocení nanomateriálů a antimikrobiálních povrchů,
  • studium biofilmů klinicky významných patogenů,
  • mikrobiální ekologie a analýza buněčné plasticity,
  • kvantitativní fenotypizace bakteriálních buněk,
  • kombinace label-free a fluorescenčního zobrazování.

 

Vybrané publikace

Kumar et al., 2025, Advanced Science
Novel leech antimicrobial peptides, hirunipins: Real-time 3D monitoring of antimicrobial and antibiofilm mechanisms using optical diffraction tomography. 
https://doi.org/10.1002/advs.202409803

Martínez-Montelongo et al., 2024, Ceramics International
Antimicrobial activity of CuFe₂O₄ and CuFe₂O₄/ZnO: Squaring colorimetric and traditional microbiology assays with atomic force- and holotomography-microscopies. 
https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2024.11.229

Fernández-Juárez et al., 2023, Applied and Environmental Microbiology
Biofilm formation and cell plasticity drive diazotrophy in an anoxygenic phototrophic bacterium. 
https://doi.org/10.1128/aem.01027-23

Choi et al., 2021, PNAS
Three-dimensional label-free visualization and quantification of polyhydroxyalkanoates in individual bacterial cell in its native state. 
https://doi.org/10.1073/pnas.2103956118

Konzultace a aplikační podpora

SVEN BioLabs zastupuje Tomocube na českém i slovenském trhu a pomáhá laboratořím s výběrem vhodného řešení pro label-free 3D zobrazování živých buněk, mikroorganismů, biofilmů a dalších biologických modelů. Máme za sebou úspěšné instalace systémů Tomocube a další nové projekty jsou v přípravě.

Jsme v těsném kontaktu s týmem Tomocube — dynamicky se rozvíjející firmou, která přináší unikátní přístup k bezbarvicímu kvantitativnímu zobrazování založenému na holotomografii a optické difrakční tomografii. 

Kontaktujte nás pro konzultaci možností label-free 3D zobrazování s Tomocube.