Text vznikl na základě zkušeností Ivana Novotného, Ph.D. ze Servisní laboratoře světelné mikroskopie, Ústavu molekulární genetiky AV ČR, v. v. i.
Jak na vícekanálový STED
Vícekanálové STED snímání dnes otevírá nové možnosti v biologickém zobrazování – ale zároveň klade vysoké nároky na správný výběr fluorescenčních značek.
STED je metoda, která v posledních letech doznala velkých pokroků na straně hardware, ať již jde o citlivost detekce, triky odstranění šumu pomocí snímání signálu pomocí pole detektorů v podobě MATRIX detektoru, nebo přesnou definici snímaných spekter pomocí kombinace RAINBOW filtrů.
Pokud však přijde na řadu otázka vícekanálového STED snímání, vše se točí okolo možností použitých fluorescenčních značení.
 |
Tříbarevný konfokální snímek kultivovaných savčích buněk fixovaných formaldehydem, které byly označeny pro faloidinu barvivem abberior STAR GREEN, spolu s imunoznačeným komplexem jaderných pórů (Nup153, abberior STAR 580) a peroxisomy (PMP70, abberior STAR RED). |
Jak poznat fluorofor vhodný pro STED?
Základní pravidlo je jednoduché:
Emise fluoroforu se musí překrývat s vlnovou délkou deplečního laseru.
Jinak řečeno – aby fungovala stimulovaná emise, musí fluorofor „vidět“ depleční laser ve svém emisním spektru. Čím větší je tento překryv, tím efektivnější je deplece. Naopak s rostoucí vzdáleností emisního maxima od depleční vlnové délky je potřeba zvyšovat výkon laseru, což zvyšuje riziko poškození vzorku a snižuje použitelnost dané kombinace. Typickým příkladem je Alexa 488, která nebude dobře fungovat s deplečním laserem 775 nm (Obr. 1A), zatímco například Abberior STAR 635P (Obr. 1B) je pro tuto kombinaci výrazně vhodnější.
Obr.1: Spektrum A) Alexa Fluor 488, B) Abberior STAR 635P, C) Alexa Fluor 750. Laserová čára - 775 nm
Neplatí však, že „čím větší překryv, tím lepší“.
Pokud se emise a deplece překrývají v oblasti maxima, dochází k efektivnímu bleachingu fluoroforu a ztrátě signálu – jinými slovy, nezůstává prostor pro samotnou detekci (viz příklad Obr. 1C).
Tímto způsobem tedy vybereme první kandidátní fluorofor a v literatuře si ověříme, zda už byl pro STED úspěšně použit.
Pokud nechcete začínat od nuly, existují fluorofory navržené přímo pro STED – například řada Abberior STAR, která je dlouhodobě optimalizovaná právě pro tuto aplikaci.
Zároveň jsou tyto značky velmi dobře použitelné i pro konfokální mikroskopii díky své vysoké fotostabilitě, jasnému signálu a možnosti vzájemné kombinace.
Jak tedy na vhodné kombinace?
Pokud vycházíme z těchto principů a zaměříme se na praktické použití, můžeme si ukázat několik osvědčených přístupů. Pro jednokanálový STED, kdy budeme pracovat s nejběžnější deplecí – 775 nm pulsním laserem – budeme vybírat nejvíce ověřené ideální značky STAR RED (Obr. 2) nebo STAR 635P.
Obr.2: Spektrum Abberior STAR RED. Laserová čára - 775 nm
Při volbě dvou kanálů se dostáváme do situace, kdy je ideální emisní oblast již obsazená.
Jedním z řešení je využít ověřené kombinace fluoroforů, například doplnění výše zmíněných značek o Abberior STAR 580 nebo STAR ORANGE. Obě varianty jsou podpořené řadou kvalitních publikací – typickým příkladem je kombinace STAR ORANGE / STAR RED (obr. 3).
Obr.3: Spektrum kombinace Abberior STAR ORANGE a STAR RED. Laserová čára - 775 nm
Na první pohled je ale zřejmé, že taková kombinace přináší riziko crosstalku – konkrétně může docházet k tomu, že STAR RED bude detekován i v kanálu STAR ORANGE vlivem cross-excitace.
Tento problém lze do určité míry řešit pečlivým nastavením akvizice a využitím spektrálních filtrů (např. RAINBOW), případně ověřením specificity signálu pomocí single-staining experimentů.
Existuje však i systematičtější řešení, které neřeší důsledek, ale příčinu – využití tzv. long-Stokes fluoroforů.
Stokesův posuv označuje vzdálenost mezi maximem excitace a emise daného fluoroforu. Fluorescenční značky Abberior označené písmenem „L“ jsou navržené tak, aby tento posuv byl výrazně větší než u běžných fluoroforů. Například Abberior STAR 520L lze excitovat v oblasti kolem 550 nm (podobně jako Alexa Fluor 555), ale jeho emise spadá do oblasti srovnatelné se STAR RED – tedy do spektrální oblasti vhodné pro depleci 775 nm laserem (obr. 4). ;
Obr.4: Spektrum Abberior STAR 520L. Laserová čára - 775 nm
Díky tomu lze tyto dvě fluorescenční značky – STAR 520L a STAR RED – oddělit čistě na základě excitace, bez nutnosti měnit emisní okno. Prakticky tak mohou být detekovány na jednom detektoru (obr. 5).
Obr.5: Spektrum kombinace Abberior STAR 520L a STAR RED. Laserová čára - 775 nm
Tento princip lze navíc dále rozšířit. Ještě výraznější Stokesův posuv nabízí fluorofor STAR 460L (obr. 6; vizualizace je přibližná, přesné spektrum najdete zde), čímž se otevírá možnost 3-kanálového STED snímání.
Obr.6: Ilustrativní graf spektra Abberior STAR 460L. Laserová čára - 775 nm
3-kanálový STED imaging
Z výše uvedeného vyplývá, že long-Stokes fluorofor STAR 460L je pro návrh 3-kanálového STED experimentu klíčový.
Jednou z funkčních kombinací je například STAR ORANGE / STAR RED / STAR 460L (obr. 7). V tomto případě se daří dostat tři stabilní fluorofory do oblasti vhodné pro STED detekci, přičemž dva kanály jsou oddělené spektrálně a třetí je separovaný díky excitaci v modré oblasti spektra
Obr.5: Spektrum kombinace Abberior STAR 460L, STAR ORANGE a STAR RED. Laserová čára - 775 nm
Výsledkem je robustní vícekanálové snímání bez nutnosti kompromisů v nastavení nebo výrazného rizika crosstalku. Nejde přitom pouze o teoretický koncept – tuto strategii potvrzují recentní publikace demonstrující praktické využití těchto fluoroforů v bioimagingu:
- Nature Neuroscience (2025) Benoit, C. M., et al. Axon initial segment dynamics during associative fear learning
- Nature Communications (2025) Wang, J., et al. BAI adhesion-GPCRs perform distinct functions in neural development differentially controlled by RTN4R and C1ql
Jak vám můžeme pomoci s výběrem fluoroforů
Návrh vhodných kombinací pro vícekanálový STED ale v praxi často není triviální – zejména pokud pracujete s konkrétními biologickými modely nebo omezeným spektrem značení.
Ve SVEN BioLabs se této problematice věnujeme dlouhodobě jako oficiální partner ABBERIOR Instruments pro Českou republiku a dodavatel fluoroforů Abberior STAR. Pomáháme s návrhem vhodných kombinací, optimalizací experimentů i ověřením funkčnosti v konkrétních aplikacích. Pokud si nejste jistí výběrem, rádi vám doporučíme vhodnou kombinaci nebo zajistíme testovací vzorky pro vaše experimenty.
Zároveň podporujeme uživatele, kteří s těmito fluorofory publikují – při citaci Abberior STAR v odborné publikaci nabízíme individuální podmínky pro další nákup.
Veškerá spektra byla analyzována pomocí databáze a nástroje FPbase: https://www.fpbase.org/spectra/
Kontaktujte nás nebo si napište o vzorek.
Potřebujete poradit s výběrem fluoroforu pro STED nebo multiplexní zobrazování?
Rádi vám pomůžeme s návrhem optimální kombinace pro váš experiment.