Sekundární detekce fluorescenčních proteinů (FP) je často nezbytná k zesílení signálů z cílů s nízkou abundancí nebo k obnovení fluorescence ztracené během přípravy tkáně. Při navrhování konstrukce fluorescenčního reportéru nebo transgenního modelu vyžaduje výběr ideálního reportérového genu vyvážení intenzity signálu, fotostability, strukturální sestavy a charakteristik tkáně.

Jakmile dojde k expresi vašeho konstruktu, stává se detekce a zesílení signálu pomocí primárních protilátek nezbytnou pro překonání autofluorescence nebo potlačení signálu způsobeného fixací aldehydem. Použití primárních protilátek z kuřecího IgY zajišťuje maximální zesílení signálu cíle bez jakékoli zkřížené reaktivity vůči savčím Fc receptorům nebo hostitelským IgG. 

Níže najdete technický popis, který vám pomůže vybrat optimální zelený nebo červený reportérový tag pro vaše experimentální uspořádání, spolu s odpovídajícími detekčními nástroji na bázi IgY.

 

Význam hostitele primární protilátky: Výhoda kuřecího IgY

Použití primárních protilátek savců ve vzorcích tkání myší, potkanů nebo lidí může vést k vysokému nespecifickému pozadí v důsledku zkřížené reaktivity sekundárních protilátek a vazby na endogenní Fc-receptory. IgY, převládající sérový imunoglobulin u kuřat, nabízí oproti konvenčnímu savčímu IgG zřetelné biochemické výhody:

  • Žádná vazba na Fc-receptory: Kuřecí IgY se neváže na savčí Fc-receptory, čímž drasticky snižuje pozadí barvení v imunitních buňkách a tkáňových řezech.
  • Žádná zkřížená reaktivita se savčím IgG: Sekundární protilátky vyprodukované proti kuřecímu IgY nevykazují zkříženou reaktivitu s myšími, králičími nebo lidskými protilátkami ve stejném koktejlu.
  • Zesílení signálu: Jelikož se tento polyklonální IgY váže na více vazebných míst v celé struktuře fluorescenčního proteinu, váže se spolehlivě i v případě, že chemická fixace poškodí nebo zakryje jednotlivé epitopy.

Díky přidání našich nových kuřecích protilátek IgY namířených proti mNeonGreen a ZsGreen nyní naše portfolio reportérových protilátek pokrývá šest nejčastěji používaných zelených, červených a dalekozelených fluorescenčních značek. 

 

Výběr správného zeleného reportéru:

mNeonGreen    vs.    ZsGreen vs. GFP

Ačkoli všechny tři značky vyzařují ve zeleném spektru, jejich ideální použití závisí na jejich kvartérní struktuře a biofyzikálních vlastnostech.

 

ZsGreen

  • Struktura: tetramerický komplex (~105 kDa)
  • Emisní vrchol: ~505 nm (smaragdově zelená)
  • Klíčová vlastnost: Vysoká fotostabilita a vynikající poměr signálu k šumu.
  • Kdy použít: ZsGreen zvolte pro sledování buněčných linií, testy aktivity promotorů nebo značení celých buněk, kde je vyžadována fotostabilita a nehrozí riziko toxicity proteinové fúze.
  • Detekce: Použijte v kombinaci s protilátkou Anti-ZsGreen IgY k zacílení na exponované strukturální epitopy na plně sestaveném tetramerickém komplexu.

 

GFP

  • Struktura: Monomerní (~27 kDa)
  • Emisní vrchol: ~509 nm (True Green)
  • Klíčová vlastnost: Klasický, široce ověřený reportérový standard.
  • Kdy použít: Zvolte GFP při práci s ověřenými vektory, při práci se zavedenými transgenními liniemi nebo pokud je prioritou kompatibilita.
  • Detekce: Použijte v kombinaci s protilátkou Anti-GFP IgY. Poznámka: Vzhledem k odlišnosti sekvencí protilátky proti GFP obecně nerozpoznávají mNeonGreen ani ZsGreen.

 

mNeonGreen

  • Struktura: Monomerní (~27 kDa)
  • Emisní maximum: ~517 nm (limetkově zelená)
  • Klíčová vlastnost: Vysoký kvantový výtěžek a jas (3–5× jasnější než EGFP).
  • Kdy použít: Zvolte mNeonGreen při práci s knock-iny s nízkou expresí, slabými promotory nebo monomerními proteinovými fúzemi, u nichž je třeba zabránit agregaci cílového proteinu. 
  • Detekce: Použijte v kombinaci s protilátkou Anti-mNeonGreen IgY k zesílení slabých endogenně exprimovaných signálů po fixaci aldehydem.


Výběr správného červeného reportéru: mCherry vs. mScarlet3 vs. mKate2
Při výběru červených nebo dalekoz červených reportérů pro kombinaci se zelenými kanály volte reportér na základě fotostability, požadavků na jas a hloubky tkáně:

Spektrum fluorescenčního proteinu s červeným vyzařováním
mScarlet3
Struktura: monomerní (~27 kDa)
Vrchol emise: ~596 nm (teplá červená)
Klíčová vlastnost: Nejvyšší kvantová účinnost mezi červenými monomerními proteiny.
Kdy použít: Zvolte mScarlet3, pokud potřebujete absolutně nejjasnější dostupný monomerní červený signál pro cíle s nízkou abundancí nebo pro rychlé zobrazování živých buněk.
Detekce: Spárujte s protilátkou Anti-mScarlet3 IgY pro čisté oddělení a zesílenou detekci exprese s nízkým počtem kopií.

mCherry
Struktura: Monomerní (~27 kDa)
Vrchol emise: ~610 nm (tmavě třešňová)
Klíčová vlastnost: Rychlé zrání a osvědčená spolehlivost
Kdy použít: Zvolte mCherry pro obecné dvoubarevné kolokalizační testy v kombinaci se zelenými reportéry, standardními savčími expresními vektory a expresí v různých typech buněk.
Detekce: Spárujte s protilátkou Anti-mCherry IgY pro spolehlivou sekundární detekci s nízkým pozadím.
mKate2
Struktura: monomerní (~27 kDa)
Emisní vrchol: ~633 nm (daleká červená)
Klíčová vlastnost: Emise v oblasti daleké červené pro maximální penetraci tkáně a minimální spektrální překrývání.
Kdy použít: Zvolte Anti-mKate2 pro řezání silných tkáňových řezů, IHC celých preparátů a tkáně s vysokou autofluorescencí pozadí, čímž minimalizujete spektrální překrývání s kratšími vlnovými délkami.
Detekce: Použijte v kombinaci s protilátkou Anti-mKate2 IgY pro maximální penetraci světla a vysoce kontrastní zobrazování v hustých tkáňových vzorcích.