SmartSPIM — light-sheet mikroskop pro velkoobjemové zobrazování transparentních biologických vzorků
Fluorescenční light-sheet mikroskop navržený pro rychlé 3D zobrazování velkých opticky transparentních vzorků při zachování vynikající kvality obrazu a subcelulárního rozlišení. Kombinací technologie Axially Swept Light-Sheet (ASLS) a synchronizace s rolling shutter režimem sCMOS kamery poskytuje SmartSPIM homogenní osvětlení a téměř konstantní axiální rozlišení v celém zorném poli. Díky tomu umožňuje rychlé a vysoce kvalitní snímání náročných vzorků, jako jsou celé dospělé myší mozky, plíce, embrya nebo dokonce celá těla myší.
Systém umožňuje zobrazování vzorků o velikosti až 40 × 70 mm rychlostí až 20 snímků za sekundu, což z něj činí ideální řešení pro velkoobjemová zobrazovací měření. Celý dospělý myší mozek lze nasnímat s izotropní velikostí voxelu až 1,8 × 1,8 × 1,8 µm, zatímco vybrané oblasti zájmu lze pomocí objektivů s vyšším zvětšením snímat s velikostí voxelu až 0,7 × 0,7 × 0,7 µm. Vestavěný algoritmus Computational De-striping (softwarové odstranění stínových artefaktů) dále zvyšuje kvalitu obrazu potlačením stínů, které jsou pro light-sheet mikroskopii typické.
SmartSPIM je navržen pro plně automatizovaný a vysoce reprodukovatelný provoz. Veškeré klíčové funkce — včetně automatického ostření objektivu, funkce Escape & Refocus, kompenzace indexu lomu použitého imerzního média, motorizovaného polohování vzorku v osách X, Y a Z nebo přepínání emisních filtrů — jsou integrovány přímo do akvizičního softwaru.
Pro zobrazování hluboko uvnitř biologických tkání je SmartSPIM kompatibilní s moderními metodami tissue clearingu, jako jsou iDISCO/ECi, SmartBatch+ a dalšími clearovacími protokoly.
Proč je technologie Axially Swept Light-Sheet tak důležitá?
Jedna z největších předností SmartSPIM řeší zásadní nevýhodu klasické Gaussian light-sheet mikroskopie.
U běžného Gaussian light-sheet mikroskopu je světelný list nejtenčí pouze v místě svého ohniska (beam waist). Se vzdalující se polohou od tohoto bodu se postupně rozšiřuje, což vede ke zvětšování jeho tloušťky a postupnému zhoršování axiálního rozlišení směrem k okrajům zorného pole. Uživatel je tak nucen volit kompromis mezi kvalitou obrazu a rychlostí měření — buď snímat menší zorné pole s vysokým rozlišením, nebo rozdělit velké vzorky na větší počet překrývajících se dlaždic (tiles), jejichž následné spojení prodlužuje dobu akvizice i zpracování dat.
Technologie Axially Swept Light-Sheet (ASLS) tento problém elegantně řeší. Během snímání se nejužší část laserového paprsku plynule posouvá napříč celým zorným polem a její pohyb je přesně synchronizován s režimem rolling shutter sCMOS kamery. Díky této synchronizaci je každá část vzorku osvětlena nejtenčí částí světelného listu právě v okamžiku, kdy je zaznamenávána kamerou.
Výsledkem je výrazně homogennější axiální rozlišení v celém zorném poli ve srovnání s konvenčními Gaussian light-sheet systémy. Jemné buněčné struktury zůstávají ostré od středu až k okrajům obrazu, což umožňuje získat kvalitní data i z rozsáhlých opticky projasněných vzorků bez nutnosti dělat kompromisy mezi rozlišením a rychlostí snímání. Pro uživatele to znamená ostřejší snímky, kvalitnější trojrozměrné rekonstrukce, menší potřebu rozsáhlého tilingu a rychlejší snímání velkých biologických vzorků, jako jsou celé myší mozky nebo jiné intaktní orgány.
Běžný Gausiánní dual-side light-sheet SmartSPIM
EGFP značené neurony v lézi způsobující epilepsii. SmartBatch+ clearing.
Proč SmartSPIM poskytuje výjimečnou kvalitu obrazu
SmartSPIM
- Technologie Axially Swept Light-Sheet (ASLS).
- Multiimerzní dipping objektivy optimalizované pro zobrazování opticky projasněných tkání.
- Motorizované přeostřování detekčního objektivu v závislosti na hloubce snímání.
- Kompenzace indexu lomu použitého imerzního média.
- Integrovaný automatizovaný workflow pro akvizici a následné zpracování obrazových dat.
Konvenční Gaussian light-sheet mikroskopie
- Světelný list se postupně rozšiřuje směrem od svého ohniska (beam waist).
- Pevně daná poloha detekčního objektivu.
- Výraznější optické aberace při snímání hluboko uvnitř vzorku.
- Výraznější zhoršování axiálního rozlišení směrem k okrajům zorného pole.
Režimy snímání
- Fluorescenční snímání s optickým řezáním pomocí light-sheet mikroskopie.
- Z-stack snímání.
- Oboustranné osvětlení vzorku (levý/pravý light-sheet).
- Snímání více zorných polí (tile scan).
- Snímání více pozic vzorku, popřípadě více vzorků naráz.
Zobrazovací komory a držáky vzorků
Chemicky odolné zobrazovací komory a držáky vzorků kompatibilní s širokou škálou zobrazovacích médií, včetně vody, BABB, DBE, ECi, SmartBatch+ (EasyIndex) a dalších projasňovacích roztoků.
| Komora | Rozměry (Š × D × V) | Objem | Určení |
|---|---|---|---|
| Malá komora | 55 × 85 × 65 mm | 300 ml | ideální pro jeden dospělý myší mozek |
| Velká komora | 80 × 200 × 63 mm | 700 ml | vhodná až pro tři dospělé myší mozky |
Myší mozek vyclearovaný pomocí SmartBatch+ zality v agarosovém gelu.
| Rozsah pohybu | 100 × 50 × 50 mm |
| Rozlišení enkodérů | 10 nm |
| Opakovatelnost polohy | 200 nm |
| Maximální rychlost pohybu | 1,75 mm/s |
- Systém pro snadné uchycení držáku vzorku umožňuje jeho rychlou instalaci a přesné polohování.
- Flexibilní konstrukce držáků vzorků (26 × 15 × 10 mm) podporuje širokou škálu velikostí vzorků, jejich orientací i konfigurací pro současné snímání více vzorků. Na přání lze snadno navrhnout a vyrobit držáky přizpůsobené specifickým experimentálním požadavkům.
- Maximální zobrazovací oblast až 40 × 70 mm (v laterálních rozměrech).
Osvětlování a lasery
- Širokopásmové osvětlovací objektivy s numerickou aperturou NA 0,125, navržené na míru s chromatickou korekcí v celém podporovaném rozsahu vlnových délek.
- Nastavitelná optika světelného listu umožňuje optimalizaci jeho tloušťky a šířky podle použitého detekčního objektivu a velikosti zorného pole.
- Oboustranné osvětlení minimalizuje stínové artefakty a zajišťuje homogenní osvětlení v celém objemu vzorku.
- Možnost optického přizpůsobení různým imerzním médiím a indexům lomu zajišťuje optimální kvalitu obrazu pro širokou škálu transparentizačních protokolů.
- Nezávislé nastavení offsetů jednotlivých osvětlovacích kanálů umožňuje kompenzaci chromatických posunů ohniska, optických aberací i posunů fokální roviny způsobených změnami indexu lomu uvnitř vzorku.
- Technologie Axially Swept Light-Sheet (ASLS) synchronizovaná s režimem rolling shutter sCMOS kamery zajišťuje vysoce homogenní axiální rozlišení a minimalizuje fluorescenci mimo rovinu zaostření v celém zorném poli.
- Softwarově řízené nastavení výkonu laserů s minimálním krokem 1 %.
| Vlnová délka | Výkon |
|---|---|
| 405 ± 5 nm | |
| 445 ± 5 nm | |
| 488 ± 5 nm | 150 mW |
| 561 ± 5 nm | 150 mW |
| 638 ± 5 nm | 140 mW |
| 785 ± 5 nm |
Detekční objektivy a detekce
Na míru navržené dipping objektivy s korekcí na nekonečno (infinity-corrected), optimalizované pro širokou škálu imerzních médií, včetně vody, BABB, EasyIndex, imerzního oleje, DBE, ECi a dalších transparentizačních roztoků, pokrývající rozsah indexů lomu RI 1,338–1,558.
| Objektiv | Pracovní vzdálenost (WD) | Pixel size | Zorné pole (FOV) | Tloušťka light-sheetu |
|---|---|---|---|---|
| LCT 1,6× / 0,1 NA | 17,5 mm | 4 µm | 8 mm | ≤ 8 µm |
| LCT 3,6× / 0,2 NA | 17,5 mm | 1,8 µm | 3,6 mm | ≤ 3,8 µm |
| ASI 9× / 0,3 NA | 18 mm | 0,7 µm | 1,4 mm | ≤ 2,5 µm |
| ASI 15× / 0,4 NA | 12 mm | 0,42 µm | 0,85 mm | |
| ASI 22× / 0,7 NA | 10 mm | 0,295 µm | 0,6 mm |
- Širokopásmová chromatická korekce v rozsahu vlnových délek od 400 nm až po blízkou infračervenou oblast (NIR).
- Plně automatizované ostření objektivu, včetně funkce Escape & Refocus.
- Snadná a rychlá výměna objektivů bez nutnosti vyjmutí vzorku ze zobrazovací komory.
| Rozsah pohybu objektivu | 50 mm |
| Rozlišení enkodérů | 10 nm |
| Opakovatelnost polohy | 200 nm |
| Maximální rychlost pohybu | 1,75 mm/s |
| Kanál | Filtr |
|---|---|
| DAPI | |
| GFP | 525/50 |
| mCherry | 600/50 |
| Cy5 | 700/75 |
| — |
Kamera
| Model | Monochromatická vědecká kamera Hamamatsu ORCA-Fusion BT (C15440) |
| Typ senzoru | sCMOS s rolling shutter synchronizovanou s technologií Axially Swept Light-Sheet (ASLS) |
| Rozlišení senzoru | 2304 × 2304 pixelů (5,2 MP) |
| Pixel size | 6,5 × 6,5 µm |
| Chlazení senzoru | −8 °C (při pokojové teplotě 25 °C) |
| Maximální kvantová účinnost (QE) | > 95 % (při 550 nm) |
| Kapacita pixelu (Full Well Capacity) | ≥ 15 000 elektronů |
| Dynamický rozsah | ≥ 20 000 : 1 |
| Read noise | < 0,7 elektronu RMS |
| Temný proud | < 1,0 elektronů/pixel/s (při −5 °C) |
| Rozsah časů expozic | 17 µs až 10 s |
| Maximální snímková frekvence (plné rozlišení) | 30 fps (16-bit) · 40 fps (12-bit) · 60 fps (8-bit) |
| Digitální výstup | 16-bit |
| Rozhraní pro připojení k počítači | USB 3.1 |
Akviziční software
- Uživatelsky přívětivý akviziční software poskytující kompletní kontrolu nad mikroskopem, kamerou i celým procesem snímání.
- Vestavěné nástroje pro rychlé a přesné zarovnání světelného listu a optimalizaci optického systému.
- Kompletní ovládání motorizovaného polohování vzorku, včetně navigace v osách X, Y a Z a lokalizace vzorku.
- Vícedimenzionální akvizice podporující Z-stacky, více fluorescenčních kanálů a experimenty s více pozicemi.
- Definování oblastí zájmu (ROI) při malém zvětšení s možností následného snímání vybraných oblastí při vyšším zvětšení pouhou výměnou detekčního objektivu, bez nutnosti vyjmutí nebo přepolohování vzorku. (Funkce je ve vývoji.)
- Automatická konfigurace tile scanu pro snímání rozsáhlých vzorků.
- Automatizované akviziční workflow optimalizované pro širokou škálu zobrazovacích aplikací.
- Předzpracování obrazových dat v reálném čase během akvizice, včetně korekce pozadí a Computational De-striping.
- Obrazy jsou ukládány ve standardním formátu TIFF, který zajišťuje kompatibilitu s běžně používaným softwarem pro 3D/4D vizualizaci, rekonstrukci, stitching a dekonvoluci.
Software pro zpracování obrazových dat
Workflow zpracování obrazových dat systému SmartSPIM je navržen tak, aby automatizoval následné zpracování rozsáhlých 3D datových souborů a zároveň minimalizoval potřebu zásahu uživatele. Systém využívá dvě dedikované pracovní stanice pracující paralelně:
- Akviziční pracovní stanice — řídí mikroskop, kameru a proces snímání a současně ukládá surová obrazová data.
- Výpočetní pracovní stanice — průběžně monitoruje akviziční stanici, automaticky detekuje nově získaná data a okamžitě zahajuje jejich zpracování, včetně Computational De-striping, přípravy dat a stitchingu.
Tento paralelní workflow výrazně zkracuje dobu mezi dokončením akvizice a vytvořením finálního datového souboru, což umožňuje efektivní zpracování rozsáhlých experimentů v light-sheet mikroskopii.
Klíčové vlastnosti
- Samostatný software pro zpracování obrazových dat pracující nezávisle na akvizičním softwaru.
- Algoritmy Computational De-striping pro redukci stínových a proužkových artefaktů.
- Automatizovaný workflow zpracování dat s monitorováním složek pro okamžité zahájení zpracování po dokončení akvizice.
- Automatická příprava datových souborů pro stitching.
- Automatický stitching rozsáhlých 3D datových souborů.
- Korekce pozadí prováděná v reálném čase během akvizice.
- Flat-field correction (korekce nerovnoměrného osvětlení) pro zajištění homogenní intenzity obrazu.
- Součástí systému je také dodatečná offline licence pro zpracování dat, kterou lze nainstalovat na pracovní stanici nebo virtuální počítač — rozsáhlé datové soubory tak lze zpracovávat bez blokování akvizičního systému.
- Vestavěný Imaris Converter pro snadný převod dat do formátu kompatibilního se softwarem Imaris.
Minimální specifikace pracovních stanic
Akviziční pracovní stanice
- 8jádrové CPU (Passmark v10 — min. 18 000 bodů)
- 64 GB DDR4 M.2 Quad Channel Memory
- min. onboard GPU
- 1 TB Intel M.2 systémový SSD
- 32 TB interní úložiště
- 10GB síťová karta
- Microsoft Windows 10 Professional (64-bit)
- 34" monitor (3480 × 1440)
Výpočetní pracovní stanice
- 24jádrové CPU (Passmark v10 — min. 50 000 bodů)
- 128 GB Quad Channel Memory
- GPU s minimálně 2 GB VRAM
- 500 GB NVMe M.2 systémový SSD
- 45 TB Raid 0 interní úložiště (HDD)
- 10GB síťová karta
- Microsoft Windows 10 Professional (64-bit)
