Technologie

SignaGen Laboratories (SignaGen) je firma zaměřená na vývoj a výrobu nástrojů pro transfekci genů. Na základě našich unikátních technologických platforem (patenty, US PTO # 61135606 & 072308) společnost SignaGen úspěšně vyvinula tři kategorie DNA/RNA transfekčních činidel, u nichž bylo ověřeno, že snadno překonávají ostatní produkty na trhu díky svojí extrémně vysoké účinnosti a nízké cytotoxicitě.

1. Syntéza biologicky rozložitelných polymerů (BDP):

Technologie BDP je patentovanou technikou (US PTO # 61135606 & 072308), která umožňuje syntetizovat biodegradabilní polykationtový polymer. Na rozdíl od jiných dostupných kationtových polymerů, jako jsou poly(L-lysin) a poly(ethylenimin) a kationtové liposomy, má tento nový polymer jedinečnou páteř, která může být rozložena poté, co genový vektor uvolní DNA/RNA uvnitř savčích buněk (obrázek 1), což vede k extrémně nízké cytotoxicitě. Kromě toho bylo zjištěno, že tento nový polymer má vynikající afinitu k nukleovým kyselinám a vysokou pufrační kapacitu, což jsou základní kritéria pro dobrý genový nosič. Pokusy s transfekcí DNA in vitro ukázaly, že tento nový biologicky odbouratelný polymer je při přenosu DNA do buněk HEK293T 2x až 10krát účinnější než poly(ethylenimin).

Obrázek 1. Ilustrace znázorňující transfekci DNA pomocí biologicky rozložitelného polymeru

2. Technologie simulující virové proteiny (VIP):

Genová terapie je pokročilá technologie v léčbě lidských jak genetických tak získaných onemocnění prostřednictvím dodání a vnitřní exprese léčiv pomocí terapeutických genů. Použití bezpečných, účinných a kontrolovatelných nosičů genů je jedním z předpokladů úspěchu klinické genové terapie. Virové vektory jsou sice při dodávání genů velmi účinné, ale jejich potenciální bezpečnost a obavy z imunogenicity zvyšují jejich riziko při klinických aplikacích. Jako alternativu k virovým vektorům jsme vyvinuli jedinečnou technologii VIPs, která simuluje sekvenci peptidů směrujících virus do jádra buněk. Na základě této platformy VIPs je vytvořena, syntetizována a testována řada simulovaných sekvencí peptidů směrující virus do jádra buněk (např. lenvirů). Bylo potvrzeno, že v kombinaci s lipozomovým činidlem pro transfekci DNA je řada těchto simulovaných peptidů schopna proniknout jaderným pórem buňky a doručit tak DNA/RNA přímo do buněčného jádra (obrázek 2). První výsledky ukázaly, že několik simulovaných peptidů může významně - až stokrát - zvýšit účinnost přenosu genu na bázi liposomů na různé savčí buňky. Zajímavé je, že synergický efekt byl pozorován i na těžko transfekovatelných nedělících se buňkách, což poskytuje potenciální nevirální vektor nukleových kyselin pro těžko transfekovatelné buňky.

Obrázek 2. Ilustrace znázorňující synergický účinek simulovaného peptidu VIPs s liposomovým transfekčním činidlem

3. Technologie transfekce oholených buněk (SCT):

Technologie SCT: Architektura buněčné membrány je tvořena lipidovou dvojvrstvou. Lipidy jsou amfipprotní v tom smyslu, že mají hydrofilní polární hlavy směřující ven a hydrofobní část tvořící jádro. Povrch buněčné membrány je však nerovný (obrázek 3-I). Součástí membrány je také spousta periferních membránových molekul včetně glykolipidů, glykoproteinů, sacharidů glykolipidů a transmembránových proteinů, iontových kanálů. Kromě toho je většina buněk popkryta dalšími typy proteinů, které umožňují jejich vazbu na jiné buňky nebo na extracelulární matrix. Jsou známy jako molekuly buněčné adheze (CAM). Všechny tyto periferní membránové molekuly se označují jako buněčné "chloupky" (obrázek 3-I), které ale brání transfekčnímu komplexu (obrázek 3-II a III) v přístupu a průniku do buňky, což ohrožuje endocytózu transfekčního komplexu. To je důvod, proč běžný transfekční postup obvykle vede k nižší účinnosti transfekce, zejména u obtížně transfekovatelných buněk. Abychom obešli tuto bariéru „buněčných chloupků“ bránící endocytóze transfekčního komplexu, vyvinuli jsme jedinečná transfekční činidla s vlastními transfekčními protokoly. Při našem patentovaném transfekčním postupu nazvaném "Shaved Cell Transfection (SCT)" se před provedením transfekce dočasně oholí chloupky buněk a následně se oholené buňky znovu převedou do inkubačního prostředí (Obrázek 3-IV a V). Technologie SCT umožňuje transfekčnímu komplexu snadno a účinněji pronikat buněčnou membránou, což vede k 3~15krát vyšší účinnosti než u neoholených buněk (obr. 3-V a VI). Technologie SCT je mimořádně užitečná pro transfekci obtížně transfekovatelných buněk.

Obrázek 3. Ilustrace ukazující, jak funguje technologie transfekce oholených buněk

4. Technologie TMCR (Transfection Mediated Cytotoxicity Removal):

Výzkumníci se při transfekčních operacích DNA/siRNA často setkávají s dilematem: transfekční činidlo s vysokou účinností obvykle vykazuje silnou cytotoxicitu. Někdy je toxicita tak silná, že po transfekci zahyne velké množství buněk. Výzkumníci proto musí obětovat účinnost transfekce ve prospěch ochrany a zachování alespoň části relativně zdravých buněk. Potlačením cytotoxicity vyvolané transfekcí poskytujeme řešení, jak dosáhnout maximální účinnosti transfekce při zachování dobré životaschopnosti buněk. Bylo prokázáno, že právě transfekční komplex ulpívající na povrchu buněk je příčinou následné cytotoxicity (obrázek 4, horní panel). Vzhledem k povaze transfekčního komplexu není možné komplex po transfekci vymýt pouhou výměnou média. Vyvinuli jsme jedinečný produkt, ve kterém je smícháno několik chemických látek tak, že vzniká koktejl (patent v řízení, US PTO # 62375686), který odstraní veškerý přebytečný transfekční komplex navázaný na povrch buněk během 5 minut inkubace při pokojové teplotě (obr. 4, spodní panel), čímž minimalizuje cytotoxicitu zprostředkovanou transfekcí.

Obrázek 4. Ilustrace znázorňující, jak funguje technologie TMCR (Transfection Mediated Cytotoxcity Removal)

5. Technologie PDCC (pH Dependent Conformational Change) pro účinné doručení siRNA:

Zatímco lipozomová nebo polymerní činidla poskytují velmi dobrou účinnost transfekce DNA, žádné z nich nedokázalo účinně dopravit siRNA do savčích buněk. Špatná účinnost siRNA transfekčních činidel na bázi liposomů nebo polymerů souvisí s délkou aniontového segmentu siRNA, který je příliš krátký na to, aby udržel elektrostatickou soudržnost s kationtovými lipidy nebo polykationtovým polymerem. V důsledku toho se lipoplex nebo polyplex siRNA při kontaktu s polyaniontovým povrchem buňky příliš snadno rozpadá. Modifikovali jsme liposom a polymer pomocí specifických hydrofobních skupin, které zajišťují konformační změny závislé na pH (PDCC) za podmínek fyziologického pH a výrazně stabilizují lipoplex nebo polyplex siRNA. Neméně důležitou vlastností vyplývající z technologie PDCC je možnost kontrolovat siRNA lipoplex nebo polyplexové nanočástice přidáním specifických hydrofobních skupin tak, aby měly velikost podobnou viru, což vede k mnohem lepší účinnosti transfekce siRNA.

Obrázek 5. Ilustrace znázorňující, jak funguje technologie PDCC (pH dependentní konformační změna)

6. Technologie Ad.MAX™ pro maximální produkci adenovirů:

Technologie Ad.MAX™ byla vyvinuta pomocí genetické modifikace buňky HEK293, tvořící virové partikule a adenovirového nosiče vektoru nebo adenovirového genomu, pro maximální produkci adenovirů. Jádro této patentované technologie spočívá v geneticky upravené buňce HEK293, v níž je replikace adenoviru zachována, zatímco exprese virových proteinů během procesu balení adenoviru je výrazně potlačena. V kombinaci s trans-elementem v genomu adenoviru, který rozpoznává supresorovou kazetu buňky HEK293, umožňuje systém Ad.MAX™ maximální produkci adenoviru s minimální expresí virového proteinu během balení viru. Tento systém je mimořádně užitečný pro balení adenovirových vektorů s toxickými geny (GOI), které by jinak během replikace a produkce adenoviru HEK293 zabily (Obrázek 6), což by vedlo k dramatickému snížení výtěžnosti adenoviru. Technologie Ad.MAX™ umožňuje do adenoviru integrovat konstrukt se všemi geny (<7,5 kb).

Obrázek 6. Ilustrace znázorňující fungování technologie Ad.MAX™

7. Více přístupů k produkci super infekčních částic rAAV v super vysoké titraci:

Na rozdíl od adenoviru je poměrně obtížné dosáhnout vysokého výtěžku rAAV běžnými postupy výroby rAAV. Použitím následujících vícekrokových strategií se nám podařilo vyrobit superinfekční (~30krát lepší infekční schopnost než u běžného rAAV) částice rAAV v super vysokém titru (až 1E+15 GC).

- Balicí buňka AAV-HT™: Prověřili jsme různé typy buněk HEK293 a vyvinuli vysoce produktivní kmen------AAV-HT™, který podle našich validačních údajů produkuje ~10krát více částic rAAV než běžná HEK293.

- Modifikace cis vektoru rAAV: Zákazník má možnost zvolit si cis vektor rAAV se zkrácenou kazetou WPRE za transgenem. Začlenění kazety WPRE do rAAV cis vektoru umožňuje produkovat ~8krát více částic rAAV než rAAV cis vektor bez WPRE.

- Modifikace kapsidy rAAV: Mutace kapsidy rAAV na několika specifických místech výrazně (~30krát lepší in vitro a in vivo) zvýšily účinnost transdukce rAAV. Zákazníci mají možnost zvolit si balení rAAV s mutovanými kapsidami, aby získali infekčnější vektor rAAV.

- Balíček Double-stranded AAV (dsAAV): Je potvrzeno, že dvouřetězcový AAV (dsAAV), známý také jako samokomplementární AAV (scAAV), poskytuje až 50krát lepší účinnost transdukce jak in vitro, tak in vivo.

Nabízíme zakázkovou produkci takových vektorů nesoucí gen, který požadujete ve vektoru scAAV*.

- Pokročilý protokol dvojité ultracentrifugace CsCl: Hlavním rysem pokročilého protokolu je ošetření speciálně vyvinutým detergentem po cyklu 3xzmrazení/rozmrazení a předsrážecím kroku před naložením do ultracentrifugace. Pokročilý protokol produkuje superpurifikovaný (kvalita pro klinické studie) a superinfekční vektor rAAV s vysokou výtěžností. Podrobnosti viz obrázek 8. Rozdíly oproti konvenčnímu protokolu jsou orámovány růžově.

Obrázek 7. Více přístupů k produkci super infekčních částic rAAV v super vysoké titraci

Obrázek 8. Náčrt a srovnání pokročilého a konvenčního protokolu. Rozdíly v pokročilém protokolu jsou orámovány růžově.

8. Balicí systém LentiMAX™ pro maximální výtěžnost:

Po ko-transfekci směsi lentivektoru a obalového lentiviru vznikne uvnitř obalových buněk velké množství dvouvláknové RNA (dsRNA). Hromadění dsRNA v cytoplazmě pak aktivuje interferonem indukované antivirové obranné dráhy. Konkrétně se po navázání dsRNA aktivuje interferonem indukovaná proteinkináza (PKR). Aktivovaná PKR fosforyluje eukaryotický iniciační faktor-2α (eIF-2α), což vede k zablokování iniciace syntézy proteinů. To vede k inhibici balení a translace virové RNA, což následně ovlivňuje stabilitu a zpracování proteinů specifických pro lentivirus (obr. 9 horní panel). Potvrdilo se, že inhibitor PKR významně zvyšuje titr lentivirového viru.

Na tomto základě jsme úspěšně vyvinuli balící systém LentiMAX™ pro lentiviry zařazením konstruktu shRNA zaměřeného na specifickou variantu PKR pod promotorem U6. Díky inhibici PKR zavedením PKR shRNA během balení lentiviru vzniká lentivirus v množství až 10^7 TU/ml ze supernatantu balících buněk, což je 10krát více než při konvenčním způsobu balení (obr. 9, spodní panel).

Obrázek 9. Ilustrace znázorňující fungování obalového systému LentiMAX™.